Ejercicios para reforzar los conceptos de actividad enzimática

1

Se realiza un ensayo de lactato deshidrogenasa en una muestra de suero, mezclando los componentes indicados en la tabla.

lactato + NAD piruvato + NADH

Al cabo de 2 minutos de iniciar la reacción se detecta espectrofotométricamente la formación de 7 µmol de NADH.

Calcula:

1. el valor de la actividad enzimática en la mezcla de reacción
2. el valor de la actividad enzimática en los 100 µl de suero
3. la concentración de actividad enzimática en el suero
4. la actividad enzimática específica en el suero, referida a masa total de proteína, si el suero tiene 30 g/l de proteínas.

a) En la mezcla de reacción AE_r = 7 µmol / 2 min = 3.5 µmol/min

b) En la alícuota de suero empleada AE_s = 3.5 µmol/min (la cantidad de enzima en los 100 µl de suero es la misma que hay en la mezcla completa)

c) En el suero [AE]_s = 3.5 µmol/min / 100 µl = 35 mM/min

d) En el suero AEE_s = 35 mM/min / 30 g/l = 1.17 (mmol/min)/(g proteínas) = 1.17 mmol min⁻¹ g⁻¹

2

Se realiza un ensayo de lactato deshidrogenasa en una muestra de suero, mezclando los componentes indicados en la tabla.

lactato + NAD piruvato + NADH

Al cabo de 3 minutos de iniciar la reacción se detecta espectrofotométricamente una concentración 6 mM de NADH.

Calcula:

1. el valor de la actividad enzimática en la mezcla de reacción
2. el valor de la actividad enzimática en los 100 µl de suero
3. la concentración de actividad enzimática en el suero
4. la actividad enzimática específica en el suero, referida a masa total de proteína, si el suero tiene 30 g/l de proteínas.

a) En la mezcla de reacción AE_r = 6 mM × 1 ml / 3 min = 2 µmol/min

b) En la alícuota de suero empleada AE_s = 2 µmol/min

c) En el suero [AE]_s = 2 µmol/min / 100 µl = 20 mM/min

d) En el suero AEE_s = 20 mM/min / 30 g/l = 0.67 (mmol/min)/(g proteínas) = 0.67 mmol min⁻¹ g⁻¹
o bien AEE_s = 2 µmol/min / (30 g/l × 100 µl) = 0.67 mmol min⁻¹ g⁻¹

3

Se ha purificado fosfatasa alcalina a partir de una muestra de hueso, consiguiendo que muestre una sola banda cuando se analiza por electroforesis. El volumen de la disolución de enzima purificada es de 2.5 ml. Cuando se mide su concentración de proteína, se obtiene un valor de 5.5 mg/ml.

Se prepara un ensayo para determinar su actividad según la reacción indicada debajo, mezclando los componentes indicados en la tabla.

p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol + P_i

5 minutos tras añadir la enzima se añaden 0.5 ml de NaOH para detener la reacción y cuantificar el color amarillo del pNF, lo que proporciona un resultado de 0.4 mM de pNF.

Calcula la actividad enzimática específica de la fosfatasa alcalina purificada.

Se ha formado pNF: 0.4 mM × 2.5 ml = 1 µmol de pNF
En la mezcla de reacción AE_r = 1 µmol / 5 min = 0.2 µmol/min
La cantidad de proteína en los 200 µl ensayados es 5.5 mg/ml × 0.2 ml = 1.1 mg
así que AEE = 0.2 µmol/min / 1.1 mg = 0.18 mmol min⁻¹ g⁻¹