Ejercicios para reforzar los conceptos de actividad enzimática

1

Se realiza un ensayo de lactato deshidrogenasa en una muestra de suero, mezclando los componentes indicados en la tabla.

lactato + NAD piruvato + NADH

Al cabo de 2 minutos de iniciar la reacción se detecta espectrofotométricamente la formación de 7 µmol de NADH.

Calcula:

1. el valor de la actividad enzimática en la mezcla de reacción
2. el valor de la actividad enzimática en los 100 µL de suero
3. la concentración de actividad enzimática en el suero
4. la actividad enzimática específica en el suero, referida a masa total de proteína, si el suero tiene 30 g/l de proteínas.

a) En la mezcla de reacción AE_r = 7 µmol / 2 min = 3.5 µmol/min = 3.5 U = 59 nkat

b) En la alícuota de suero empleada AE_s = 3.5 µmol/min (la cantidad de enzima en los 100 µL de suero es la misma que hay en la mezcla completa)

c) En el suero [AE]_s = 3.5 µmol/min / 100 µL = 35 mM/min = 35000 U/L = 0.583 mkat/L

d) En el suero AEE_s = 35 mM/min / 30 g/L = 1.17 (mmol/min)/(g proteínas) = 1.17 mmol min⁻¹ g⁻¹ = 1170 U/g = 19.5 µkat/g

2

Se realiza un ensayo de lactato deshidrogenasa en una muestra de suero, mezclando los componentes indicados en la tabla.

lactato + NAD piruvato + NADH

Al cabo de 3 minutos de iniciar la reacción se detecta espectrofotométricamente una concentración 6 mM de NADH.

Calcula:

1. el valor de la actividad enzimática en la mezcla de reacción
2. el valor de la actividad enzimática en los 100 µl de suero
3. la concentración de actividad enzimática en el suero
4. la actividad enzimática específica en el suero, referida a masa total de proteína, si el suero tiene 30 g/l de proteínas.

a) En la mezcla de reacción AE_r = 6 mM × 1 mL / 3 min = 2 µmol/min = 2 U = 33 nkat

b) En la alícuota de suero empleada AE_s = 2 µmol/min = 2 U = 33 nkat

c) En el suero [AE]_s = 2 µmol/min / 100 µl = 20 mM/min = 20000 U/L = 0.33 mkat

d) En el suero AEE_s = 20 mM/min / 30 g/l = 0.67 (mmol/min)/(g proteínas) = 0.67 mmol min⁻¹ g⁻¹
o bien AEE_s = 2 µmol/min / (30 g/l × 100 µl) = 0.67 mmol min⁻¹ g⁻¹ = 670 U/g = 11.2 µkat/g

3

Se ha purificado fosfatasa alcalina a partir de una muestra de hueso, consiguiendo que muestre una sola banda cuando se analiza por electroforesis. El volumen de la disolución de enzima purificada es de 2.5 ml. Cuando se mide su concentración de proteína, se obtiene un valor de 5.5 mg/ml.

Se prepara un ensayo para determinar su actividad según la reacción indicada debajo, mezclando los componentes indicados en la tabla.

p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol + P_i

5 minutos tras añadir la enzima se añaden 0.5 ml de NaOH para detener la reacción y cuantificar el color amarillo del pNF, lo que proporciona un resultado de 0.4 mM de pNF.

Calcula la actividad enzimática específica de la fosfatasa alcalina purificada.

Se ha formado pNF: 0.4 mM × 2.5 ml = 1 µmol de pNF
En la mezcla de reacción AE_r = 1 µmol / 5 min = 0.2 µmol/min = 0.2 U = 3.33 nkat
La cantidad de proteína en los 200 µl ensayados es 5.5 mg/ml × 0.2 ml = 1.1 mg
así que AEE = 0.2 µmol/min / 1.1 mg = 0.18 mmol min⁻¹ g⁻¹ = 180 U/g = 3.0 µkat/g

4

Una muestra contiene la enzima X, cuya actividad se puede medir siguiendo la reacción que cataliza, A B + C
La aparición de B se detecta gracias a su absorbancia a 480 nm, longitud de onda a la que posee un coeficiente de extinción de 8800 M⁻¹ cm⁻¹
La medida de la concentración total de proteínas en la muestra rindió un valor de 20 mg/mL.

Se tomaron 100 µL de la muestra, combinándolos con 25 µL de disolución 200 mM del sustrato y 1875 µL de un tampón adecuado para la enzima. Al registrar la absorbancia de esta mezcla, se midió un aumento de absorbancia de 0.01 cada minuto.

Calcula:

1. la concentración de actividad enzimática en la mezcla de ensayo
2. la concentración de actividad enzimática en la muestra de partida
3. la actividad enzimática específica en la muestra de partida

a) Puesto que A = ε × c × l , dA/dt = ε × dc/dt × l
Como [AE] es lo mismo que dc/dt, en la mezcla de reacción [AE]_r = 0.01 min⁻¹ × (1/8800) M cm × 1/(1 cm) = 1.14·10⁻⁶ M/min = 1.14 µM/min = 1.14 U/L o bien 38 nkat/L

b) [AE]_m × 100 µL = [AE]_r × 2000 µL ; [AE]_m = 22.8 U/L o bien 760 nkat/L o 0.76 µkat/L

c) AEE_m = (22.8 U/L) / (20 g prot./L) = 1.14 U/g o bien 38 nkat/g

5

La β-galactosidasa puede hidrolizar el compuesto o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) para producir galatosa y o-nitrofenol (ONP), que en medio alcalino tiene color amarillo con un máximo de absorbancia a 615 nm y un coeficiente de extinción 4500 M⁻¹cm⁻¹.

Se mezclan en una cubeta de espectrofotómetro 900 µL de tampón de pH=7.3, 80 µL de disolución 100 mM de ONPG y 20 µL de una muestra que contiene β-galactosidasa.
Transcurridos 5 min, se añade 1 mL de NaOH 1M para detener la reacción (por inactivación de la enzima).

En esos 5 min la absorbancia a 615 nm aumentó en 0.35

Calcula:

1. la actividad enzimática en la mezcla de ensayo (durante la reacción)
2. la actividad enzimática en la muestra de partida

a) Puesto que A = ε × c × ℓ , dA/dt = ε × dc/dt × ℓ
Como [AE] es lo mismo que dc/dt, AE = V × [AE] = V × dA/dt / ( ε × ℓ )
Teniendo en cuenta que la absorbancia se ha medido en el volumen final, V = 2 mL:
AE_f = 2 mL × [AE]_f = 2·10⁻³ L × (0.35 / 5 min) × (1/4500) M cm × 1/(1 cm) = 3.11·10⁻⁸ mol/min = 0.0311 µmol/min = 0.0311 U<
y la cantidad de enzima es la misma tanto en el volumen final como en el previo durante la reacción, es decir, su AE se mantiene:
En la mezcla de reacción AE_r = 0.0311 U o bien 0.519 nkat

b) De nuevo, la cantidad de enzima es la misma en los 20 µL de muestra iniciales que en la mezcla de reacción:
AE_m = AE_r = 0.0311 U o bien 0.519 nkat