Temas 7 y 8 - Enzimas

7) Concepto, clasificación y nomenclatura de las enzimas. Conceptos de coenzima, centro activo y especificidad. Mecanismo de la catálisis enzimática. Cinética enzimática. Reacciones enzimáticas con un solo sustrato: modelo de Michaelis y Menten. Linealización de la ecuación. Inhibición de las enzimas.

8) Regulación de la actividad enzimática: su necesidad. Reacción limitante. Regulación por modificación de la cantidad de enzima. Regulación por modificación de la eficiencia catalítica: zimógenos, modificación covalente, enzimas alostéricas. Isoenzimas.

I. Introducción, conceptos, terminología

• Concepto y definición de catalizador en química
• Concepto y definición de enzima
• ¡atención! No todas las enzimas son proteínas, algunas son RNA (ribozimas)
• Necesidad de las enzimas en los seres vivos
  • Velocidad de las reacciones
  • Control de las reacciones dependiendo de necesidades de la célula o del organismo
• Características clave de las enzimas
  • Especificidad por los sustratos
  • Muy elevada eficiencia catalítica
  • Actúan en condiciones fisiológicas (pH, T)
  • Regulables
• Relevancia de las enzimas ¿Por qué las estudiamos?
  • Biológica ...
  • Aplicada
    • Industrial
      • Alimentaria – ablandar carne, fabricación de queso, comida de bebé, clarificación de zumos; usos de las levaduras
      • Transformación de productos – producción de glucosa, jarabe de fructosa, comida de animales
      • Industrias textil y del cuero
    • Doméstica
      • Detergentes (amilasa, lipasas, proteasas)
      • Limpiador de lentes de contacto
    • Medicina
      • Diagnóstico de alteraciones.
      • Ensayos de análisis de diversas sustancias.
      • Terapia (fibrinolíticos,...)

Nomenclatura y clasificación EC

• Frecuente terminación en –asa. Derivado del sustrato o del producto o del tipo de reacción
• Comisión de Enzimas (EC): N1.N2.N3.N4 (Sólo idea general)
  • N1 = clase
  • N2 = subclase
  • N3 = sub-subclase
  • N4 = enzima concreta
• Clasificación: pp.141-144    ¡atención! añadir nueva clase 7: translocasas
  1. Oxidorreductasas -- reacciones redox   (transfieren H, O, electrones)
  2. Transferasas -- transferencia de grupos entre 2 moléculas
  3. Hidrolasas -- ruptura de enlace con participación de agua
  4. Liasas -- ruptura de enlace C-C, C-O, C-N (excepto por hidrólisis u oxidación), se elimina una molécula y se forma un doble enlace o un anillo
  • en sentido opuesto, se añade un grupo a un doble enlace
  5. Isomerasas -- transferencia intramolecular de grupos
  6. Ligasas -- unión de 2 sustratos a expensas de la hidrólisis de ATP
  7. Translocasas -- movimiento de moléculas o iones a través de las membranas celulares

Aclaración: liasas frente a ligasas

• Liasas: reacciones de eliminación o de adición (no mediante hidrólisis -EC 2- ni oxidación -EC 3-). En un sentido rompen enlaces C-C, C-O, C-N (u otros), retirando un grupo y generando un doble enlace o un anillo. En el sentido opuesto, añaden grupos a un doble enlace.
• Ligasas: reacciones donde se combinan dos moléculas dando una sola, acompañado de la aportación de energía gracias a la hidrólisis de un enlace fosfodiéster (difosfato) en el ATP u otra molécula similar.
• Ya no se distingue entre sintasas y sintetasas; ambos se consideran sinónimos en los nombres comunes; en los sistemáticos se debe usar liasa o ligasa.

• Recursos recomendables:

• Enzyme Nomenclature (IUBMB - IUPAC)
• BRENDA www.brenda-enzymes.info -- esquema de la clasificación EC
• ExPASy ENZYME enzyme.expasy.org

II. Modo de acción de las enzimas

A. Interacción de la enzima con el sustrato (o los sustratos)

Terminología: sustratos, productos. Reacción.

La enzima aporta a la reacción: velocidad especificidad control regulatorio.

La reacción catalizada por la enzima:

1. Unión del sustrato (o los sustratos) S + E ES
2. Conversión de sustratos en productos ES EP
3. Liberación de los productos EP E + P

Sitio de unión y sitio activo:

animaciones (simples pero ilustrativas, recomiendo nº 1, 2 y 3 )

• La enzima facilita el contacto y orientación de los sustratos
  • Los sustratos deben contactar (colisionar) con suficiente energía y con la orientación adecuada
  • La interacción de la enzima con los sustratos lo facilita:
    • “bolsillo de unión”, “centro de fijación del sustrato”
    • Múltiples contactos (3D) de los residuos aminoácidos o nucleótidos de la enzima
    • Enlaces no covalentes (“débiles”)
    • La enzima diferencia entre estereoisómeros
  • La enzima reduce la movilidad de los sustratos
• La enzima interviene en la transformación SP
  • “centro activo”, “centro catalítico”, “sitio activo”
    • Región de la enzima donde se unen los sustratos y donde se realiza la catálisis.
    • Habitualmente es una parte no muy grande de la enzima completa.
    • Es un bolsillo o hendidura tridimensional:
      • múltiples puntos de interacción,
      • entre los residuos de aminoácidos/nucleótidos (de diferentes partes de la estructura primaria)
      • y los sustratos;
      • interacciones no covalentes
      • aporta estereoespecificidad
    • Se genera un microambiente específico, adecuado para facilitar la reacción.
• Modelos para la unión entre enzima y sustrato:
  • Modelo inicial: de “llave y cerradura”
  • Modelo mejorado: de “ajuste inducido” o "adaptación inducida"
    • ejemplo: Cambio conformacional de la hexoquinasa
    • ejemplo: Cambios conformacionales durante una reacción enzimática

Complejo del estado de transición:

• Perfil de energía de las moléculas (S y P) a lo largo de la reacción
  • Terminología: estado de transición; variaciones de energía libre; energía de activación
  • Relación entre velocidad de la reacción y energía de activación.

B. Mecanismos moleculares de catálisis

Ilustrados con el ejemplo de la quimotripsina

Reacción de la quimotripsina. Intermediario oxianión tetraédrico.

Mecanismo de la catálisis

• Tríada catalíca Asp, His, Ser
• Catálisis ácido-base.
• Intermediario covalente unido a a enzima: Catálisis covalente.
• Mecanismo catalítico de la quimotripsina y en otra versión con más detalle (narrada en inglés)

Resumen: conceptos clave del mecanismo:

• El entorno formado por los residuos aminoácidos del centro activo facilita el ataque (grupo hidroxilo de Ser desprotonado)
• Catálisis ácido-base: varios residuos del centro activo toman y ceden H+ en varios momentos de la reacción.
  • Las concentraciones fisiológicas de H⁺ y OH⁻ son bajas; la enzima puede aportar o aceptar H⁺
  • Asp, Glu, His, Lys, Arg, (Ser, Cys, Tyr), Ade
• Catálisis covalente: intermediario unido a la E
  • Grupos nucleófilos o electrófilos de la enzima (OH, SH, =O, NH2, >N, iones metálicos)
• Fijación y estabilización de los sustratos e intermedios: por ej., enlaces de H, interacciones iónicas
• El centro de unión del S posee un “bolsillo hidrófobo” en el que encaja el residuo aminoácido del lado C del enlace peptídico, si es aromático (hidrófobo y voluminoso). Por ello, QT hidroliza enlaces Xxx-Phe, Xxx-Tyr o Xxx-Trp preferentemente (especificidad)

Otras contribuciones al mecanismo de catálisis enzimática:

• Interacciones electrostáticas
• Catálisis por iones metálicos : Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺
• Estabilización del estado de transición
• Efectos entrópicos: La unión de los S al centro activo favorece su proximidad y orientación, reduce la entropía

La enzima reduce la energía de activación, produce un estado de transición más estable

• La implicación de la enzima introduce un “camino” diferente para conseguir la misma reacción.
• Los intermediarios y estados de transición son nuevos.
• La termodinámica de la reacción no cambia; cambia su cinética (velocidad)

III. Grupos funcionales en la catálisis

En las cadenas laterales de los residuos aminoácidos del sitio de unión y sitio activo; también grupos del esqueleto polipeptídico.

“Coenzimas”, moléculas no proteicas necesarias para la catálisis:

Terminología: apoenzima y holoenzima.

Lectura opcional: "Aplicación clínica 10.3" - Enfermedad causada por la alteración del centro de unión de una coenzima.

Coenzimas que activan la transferencia de un grupo

Ilustrado con ejemplos:

Coenzimas de oxidorreducción, coenzimas redox

Ilustrado con ejemplos:

coenzima	acción	precursor
NAD, dinucleótido de nicotinamida y adenina	NAD + 2 H+ + 2 e− NADH + H+	niacina, vit  B3, vit. PP
FAD, dinucleótido de flavina y adenina	FAD + 2 H+ + 2 e− FADH2	riboflavina, vit. B2

Otras que se estudiarán más adelante: NADP, FMN

Iones metálicos como cofactores o coenzimas

• En 1/3 de las enzimas conocidas
• Contribuyen a fijar y orientar sustratos
• Estabilizan intermedios aniónicos
• Participan en reacciones redox
• Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺

IV. Factores que afectan a la actividad enzimática

• Temperatura
• pH
• fuerza iónica
• inhibidores
• regulación biológica

Conceptos: T óptima, pH óptimo.

Causas:

• (des)protonación de grupos clave en el sitio activo
• alteración de interacciones E-S
• cambios conformacionales
• pérdida total de estructura (desnaturalización)

V. Inhibidores de la actividad enzimática basados en el mecanismo

(Interfieren en alguna etapa del mecanismo de la reacción catalizada)

Lectura opcional: "Aplicación clínica 10.5" - Un caso de envenenamiento por plaguicidas.

• Inhibidores covalentes
  • Reacción irreversible con un estado intermedio
  • Por ej.: los que reaccionan con la enzima formando un enlace covalente, en un residuo del centro catalítico.
  • También los que establezcan una unión muy estable, aun no covalente
  • La enzima ya no puede actuar
  • Ejemplos: diisopropilfluorofosfato, ácido acetilsalicílico
• Análogos del estado de transición o de intermediarios
  • Es más potente un análogo del ET que uno del S
  • Ejemplos: penicilina, alopurinol
• Inhibición por metales pesados
  • Hg²⁺ , Pb²⁺ , Al³⁺ , Fe³⁺
  • Toxicidad
  • Bastante inespecíficos
  • Unión a grupos funcionales del centro activo: -SH Hg²⁺
  • Reemplazo del catión fisiológico: Ca²⁺ , Fe²⁺ , Zn²⁺ Pb²⁺

VI. Regulación de la actividad de las enzimas

[Este apartado no está explícitamente en el libro de Marks, pero es necesario para comprender lo que sigue.]

Actividad enzimática - definición

• ¿Cómo medimos actividad enzimática?
  • reacción con sustrato sintético o “artificial”
  • para poder detectar y cuantificar el sustrato o el producto
  • ejemplos...
  • AE es una medida de la cantidad de enzima y de su eficacia (si hubiese algo que la altere)
• Definiciones
  • Actividad enzimática, AE
    • Cantidad de sustrato convertido en producto por unidad de tiempo. Ej: UI , U (=µmol/min) , kat (=mol/s)
    • Medida de la cantidad de enzima (por su eficacia, no por su masa)
  • Concentración de actividad enzimática, [AE]
    • Medida de la concentración de enzima. Ej: µmol L⁻¹ min⁻¹ , kat/L
  • Actividad enzimática específica, AEE
    • Actividad por unidad de masa (de enzima o de proteínas totales)
    • Medida de la pureza o enriquecimiento de la enzima

Ejercicios para afianzar los conceptos de actividad enzimática, concentración de actividad enzimática y actividad enzimática específica.

Velocidad de reacción - definición

• Velocidad de formación de los productos
• Aumento de la concentración de productos
• Disminución de la concentración de reactivos
• ѵ = d[P] / dt = −d[A] / dt
• Equivale a la [AE]

Reversibilidad

• En principio, todas las reacciones son reversibles, con mayor o menor facilidad (termodinámica)
• En la práctica, algunas se comportan como irreversibles
  • si requiere elevada energía
  • si se elimina rápidamente el producto en otra reacción
• La enzima cataliza en ambos sentidos
• Si es reversible: A + B C
  constante de equilibrio K = k₁ / k₂ , o k₁ / k₋₁ ; K = [C] / ( [A] × [B] )

  Pero… los sistemas vivos no están en equilibrio

Progreso de la reacción: ¿cuándo debemos medir la velocidad?

Concepto de velocidad inicial

VII. Regulación por concentración de sustrato y de producto

Regulación por compuestos que se unen al centro activo reversiblemente. Iincluye: [S], [P], inhibidores reversibles.

Dependencia de la concentración de sustrato

"estudio cinético” de las enzimas

• Definición: Se estudia la velocidad de la reacción catalizada con distintas concentraciones de sustrato.
• Diseño del experimento: concentración de enzima constante (así como de cofactores, pH, T, sales...)  Ayuda:

ѵ frente a [S]: saturación, curva hiperbólica.

Modelo de Michaelis y Menten

• Hipótesis y aproximaciones.
• Ecuación
• Interpretación de la ecuación y de sus parámetros.
• Significados de K_m :
  • Cociente de constantes de velocidad.
  • ~ 1/ afinidad de E por S
  • [S] que proporciona ½ѵ_máx.
  • La mitad de los sitios activos están ocupados por S.
• Significados de ѵ_máx :
  • Todos los sitios activos están ocupados con S
  • E saturada con S
  • E trabajando a plena capacidad
  • [S] >>> K_m
• Exploración de la variación de K_m y v_máx
• Ajuste directo de los datos experimentales mediante regresión no lineal a la ecuación. Por ej., https://bit.ly/regresionMM y para el móvil: biomodel.uah.es/m
• Linealización de la ecuación: Lineweaver y Burk, y otras

Efecto fisiológico del valor de K_m : sensibilidad (con ejemplos)

Dependencia de la concentración de enzima

¿Cómo será la gráfica de Ѵ frente a [E]? Ayuda:

Ѵ_máx depende de la concentración de enzima

k_cat = ѵ_máx / c_E :: Constante catalítica

k_cat = k₃ en mecanismos sencillos como M-M
o nº de recambio = nº de moléculas S que cada sitio activo convierte en P por unidad de tiempo

Constante catalítica = nº de recambio.

Regulación de la actividad enzimática mediante inhibidores reversibles

Tipos de inhibidores y efecto en la cinética

• Inhibidor competitivo
  • habitualmente análogos estructurales del S (o del ET)
  • No modifica Ѵ_máx (puede desplazarse si aumenta S)
  • Aumenta K_m aparente
• Inhibidor no competitivo
  • No hay interacción entre la unión de S y de I; I se une igual a E que a ES
  • Reduce Ѵ_máx (no es posible desplazarlo)
  • No altera K_m .
• Situaciones mixtas
  • I se une en sitio distinto pero altera la unión de S, o I sólo se une a ES
  • Se modifica tanto Ѵ_máx como K_m .
  • “acompetitivo”, “incompetitivo”, “anticompetitivo” (No entraremos en estas distinciones)

Inhibición por producto

• Todos los P pueden tener efecto inhibidor, normalmente competitivo
• La inhibición cuando se acumula un producto (no se usa en reacciones subsiguientes de las rutas metabólicas) cumple función reguladora (retroinhibición) y economiza energía

VIII. Regulación de la actividad por cambios conformacionales de la enzima

Alostería

No insistiremos en:

• Efectos homotrópicos // Efectos heterotrópicos
• Modelo concertado // Modelo secuencial

Regulación alostérica. Enzimas alostéricas. Proteínas alostéricas.

¿Qué es? Alostería: del griego ἄλλως , allos: otro, y στερεός , stereós: forma

2 interpretaciones válidas y complementarias :

• alostería = otra forma = distintas conformaciones de la enzima que tienen distinta actividad enzimática
• alostería = otro sitio = un ligando (efector) que se une en lugar diferente al sitio activo (donde se une el sustrato) conduciendo a una actividad enzimática alterada

Efectores, ligandos alostéricos:

• modulan la actividad de la enzima
• no sufren transformación
• positivos (activadores) o negativos (inhibidores)
• típicamente moléculas pequeñas (metabolitos), pero pueden ser proteínas

Definición: la unión de un ligando en un sitio distinto al sitio activo altera la actividad de la enzima debido a que provoca un cambio conformacional en la enzima.

Ilustración ampliada, con ejemplos en 3D

Cinética de enzimas alostéricas:

• En la situación más frecuente, las enzimas alostéricas no se comportan según el modelo de Michaelis y Menten, sino que presentan curvas de cinética sigmoides.
• Los efectores positivos y negativos desplazan la curva. ¿En qué sentido?
• La enzima está en equilibrio entre 2 conformaciones (R,T)
  El efector positivo, activador, favorece (estabiliza) la conformación R, “relajada”, con más afinidad por el sustrato, con más actividad.
  El efector negativo, inhibidor, favorece (estabiliza) la conformación T, “tensa”, con menos afinidad por el sustrato, con menor actividad.

Cooperatividad (no debe confundirse con alostería; conceptos diferentes aunque pueden darse a la vez)

• Los cambios conformacionales son responsables tanto de los mecanismos de alostería como de los de cooperatividad.
• Una proteína presenta cooperatividad cuando la afinidad de un sitio que une ligando depende del estado de ocupación del resto de sitios de unión.
• =Una proteína presenta cooperatividad cuando la ocupación de un sitio que une ligando modifica la afinidad del resto de sitios de unión.
• La unión cooperativa se identifica porque genera curvas sigmoides para la función de saturación.
• La cooperatividad es uno de los fenómenos que pueden presentar las proteínas alostéricas, proteínas con sitios de unión para ligandos diferentes y cuyas subunidades, además, interaccionan entre sí.
• La cooperatividad puede ser
  • negativa: cuando la unión de una molécula de ligando disminuye la afinidad del resto de los sitios
  • positiva (que es el caso más frecuente): cuando la unión de una molécula de ligando aumenta la afinidad de los sitios desocupados

Regulación por modificación covalente

(con cambio conformacional)

• Acetilación
• ADP-ribosilación
• Unión de lípidos
• Fosforilación reversible – Lo más frecuente
  • Fosforilación y desfosforilacíón de residuos aminoácidos de la enzima.
  • Cambios conformacionales y de afinidad por sus sustratos o de capacidad catalítica.
  • Residuos aminoácidos fosforilables: los grupos alcohol: Ser, Thr, Tyr
  • Enzimas responsables: quinasas de proteínas y fosfatasas de proteínas

Reacciones de fosforilación y desfosforilación de una proteína. Concepto de quinasa y fosforilasa.

Adicional como refuerzo: importante También en

Ejemplo: quinasa de la glucógeno-fosforilasa.

Regulación por interacción entre proteínas

Regulación de la actividad enzimática debida a cambio conformacional, debido a su vez a la interacción de la enzima con otra proteína.

Ejemplo: activación de la proteína quinasa A por unión de AMP cíclico.

No estudiaremos: Calmodulina–Ca²⁺ ni Proteínas G monoméricas o pequeñas, p.155 de Marks

Activación por ruptura proteolítica

Zimógenos o proenzimas.

Ejemplos:

• Proteasas digestivas: tripsinógeno, quimotripsinógeno, pepsinógeno. [ilustrado adicionalmente en ]
• Otros ejemplos (no estudiamos detalles aquí): factores de coagulación (proteasas)

V. Regulación de las rutas metabólicas

• Rutas o vías = secuencias de reacciones sucesivas.
• Velocidad de la ruta = velocidad de la etapa más lenta (etapa limitante)
• Habitualmente, la enzima de la 1ª etapa es la que sufre regulación (enzima reguladora de la ruta)
• Frecuentemente, los productos finales de la ruta son reguladores negativos (retroinhibición)

Isoenzimas

Isoformas o variantes de una enzima.

Formas alternativas de la proteína, variantes, con alguna diferencia en su estructura y actividad:

• codificadas en genes separados
• secuencia de aminoácidos
• parámetros cinéticos
• sensibilidad a la regulación
• “preferencia” por sustratos

Resultan adecuadas para situaciones o entornos diferentes; p.ej. en distintos tejidos, especialización metabólica.

Aplicación diagnóstica (detección de isoenzimas en plasma procedentes de daño en tejidos. Ejemplos:
  Lactato deshidrogenasa (LDH)
  Creatina quinasa (CK)

Ejemplo: Lactato deshidrogenasa (LDH)

-fin-